A engenharia metabólica constitui-se como grande área de conhecimento que utiliza dados genômicos para estudo e mutação sítio-dirigida de organismos, objetivando melhores fatores de conversão de substrato em um produto desejado, geralmente de alto valor agregado. a metodologia empregada neste trabalho iniciou com uma reconstrução in silico da clostridium acetobutylicum, bactéria conhecida pela grande produção de acetato, butirato e hidrogênio. esta reconstrução foi substituída por outra mais recente e pronta para uso, mas ainda foi a melhor opção para a análise de nocaute de genes. uma análise de sensibilidade revelou a possibilidade de substituição de substrato. esta substituição de substrato foi testada experimentalmente por crescimento em batelada em biorreator anaeróbio. os trabalhos de reconstrução aqui envolvidos serviram de referência para a correção do metoolbox, que após as correções apresentou os mesmos valores de fba do cobra toolbox, constituindo-se assim como ferramenta bem estabelecida para o estudo de engenharia metabólica. os estudos de engenharia metabólica visando maximizar a produção de hidrogênio indicaram a substituição de glicose como substrato por sacarose, maltose ou lactose. nos ensaios experimentais, taxas de produção de hidrogênio semelhantes às obtidas com glicose foram obtidas com sacarose e maltose, mas claramente inferiores foram obtidas com lactose como substrato. os estudos in silico indicaram também a deleção do gene cac1742 como alternativa para maximizar a produção de hidrogênio, hipótese ainda não testada experimentalmente. a partir dos modelos não regulados já publicados, um modelo com regulação para a c. acetobutylicum foi feito, sendo seus resultados devidamente validados com dados experimentais para diferentes substratos, reproduzidos em análise de balanço de fluxos (fba), tanto em estado pseudo estacionário quanto dinâmico.